Peter Parker (Tobey Maguire) a retrouvé un équilibre de vie et il veut se marier avec Mary Jane (Kirsten Dunst). Pendant une nuit au parc, alors que Peter et Mary Jane sont ensemble, une petite météorite tombe tout près du lieu où ils se trouvent et éclate, laissant échapper une matière visqueuse, le symbiote, qui s’attache à la mobylette de Peter.

Pendant ce temps, Flint Marko (Thomas Haden Church) s’échappe de la prison où il était détenu pour cambriolage afin d’aller revoir sa fille qui lui manque terriblement, mais dont il n’a pas le droit de s’approcher à cause de l’injonction d’éloignement obtenue contre lui par son ex-femme ; pendant sa fuite, il tombe dans un accélérateur de particules, qui fond son corps avec le sable et il devient l’Homme-sable. Quant au meilleur ami de Peter, Harry Osborn (James Franco), il a récupéré l’armement du Bouffon Vert utilisé par son père et veut venger sa mort. Croyant que Spider-Man est la cause de cette mort, il l’attaque. La bataille laisse Harry avec un choc à la tête qui le rend amnésique à court terme, lui faisant oublier temporairement sa vengeance.

Plus tard, durant un festival honorant Spider-Man parce qu’il a sauvé la vie de Gwen Stacy (Bryce Dallas Howard), fille d’un policier et remettant la clé de la ville de New York au héros, cette dernière l’embrasse, ce qui crée un différend entre Peter et Mary Jane, croyant qu’il veut s’éloigner d’elle. L’Homme-sable essaye ensuite de voler un véhicule blindé contenant l’argent nécessaire pour soigner sa fille, mais Spider-Man l’arrête. Le capitaine Stacy (James Cromwell) informe plus tard à Peter et sa tante May (Rosemary Harris) que c’est en réalité Marko la personne qui a tué Ben Parker (Cliff Robertson), son oncle. L’autre voleur qui avait été pourchassé n’était qu’un complice.

Peter attend Marko pour se battre contre lui, voulant venger la mort de son oncle. Le symbiote se colle sur son costume tandis qu’il est endormi et Peter découvre que ce n’est pas seulement son costume qui a changé, mais également ses pouvoirs, qui ont augmenté. Cependant, il ignore que ce costume noir le change psychologiquement et le rend plus violent, plus égoïste et plus enragé : il fait remonter à la surface son côté sombre.

Le changement de personnalité de Peter l’éloigne de Mary Jane, qui ne réussit pas à lancer sa carrière d’actrice ; elle se console avec Harry, lequel est guéri de son amnésie (il voit une apparition de son père mort) et pousse Mary Jane à se séparer de Peter. Harry le rencontre dans un restaurant et prétend être le préféré. Plus tard, Peter le trouve chez lui, et avec l’aide de son costume noir, l’affronte dans un combat singulier, qui laisse le visage de Harry défiguré. Influencé par le costume, Peter humilie aussi Eddie Brock, un photographe qui a vendu au Daily Bugle de fausses images montrant que Spider-Man est un criminel afin de prendre la place de Peter comme pigiste. Eddie Brock est licencié à cause de Parker et jure de se venger.

Pour rendre Mary Jane jalouse, Peter emmène Gwen au Jazz, le night club où elle travaille comme chanteuse et serveuse. Peter se bat ensuite avec les videurs de la boîte et gifle Mary Jane, la projetant au sol. C’est à ce moment que Peter se rend compte que le costume l’a changé. Il sort en courant de la boîte de nuit et va à la cathédrale Saint-Patrick pour se débarrasser du symbiote. Au début, il ne peut retirer le costume, mais sans le vouloir, il frappe la grande cloche et la fait sonner. Ses vibrations affaiblissent le symbiote, permettant à Peter de se débarrasser de lui. Eddie Brock se trouve également sur place, priant pour la mort de Peter, quand le symbiote lui tombe dessus et s’accroche à lui. Ce dernier a acquis les pouvoirs de Spider-Man durant le temps qu’il a passé à l’intérieur de Peter et les transmet à Eddie, créant un double maléfique de Spider-Man : Venom (Topher Grace). Eddie, s’étant rendu compte que Peter et Spider-Man sont la même personne, trouve l’Homme-sable et lui propose de s’associer avec lui pour détruire Spider-Man.

Ils utilisent Mary-Jane comme appât pour forcer Spider-Man à les affronter. Peter va demander son aide à Harry, mais celui-ci refuse. Cependant, Harry apprend la vérité au sujet de la mort de son père grâce à son majordome Bernard (il a été tué par son propre planeur et non par Spider-Man). Il arrive à temps pour sauver Peter, s’associant avec lui contre Venom et l’Homme-sable. Pendant que le combat progresse, Brock essaye d’empaler Peter, mais Harry s’interpose et est mortellement blessé. Peter se rappelle alors que les vibrations de la cloche de l’église avaient affaibli le symbiote. Contre l’avis d’Eddie, qui voulait délibérément rester sous l’influence de Venom, il le libère en faisant résonner plusieurs tuyaux ensemble. Peter jette une bombe-citrouille au symbiote, qui meurt avec Eddie.

Après la bataille, Marko dit à Peter qu’il n’avait eu aucune intention de tuer Ben Parker : Marko l’avait fait sortir de sa voiture pour la lui voler après un braquage, mais alors que Ben tentait de le convaincre de rentrer chez lui, son complice, que Peter avait laissé fuir, est arrivé et lui a accidentellement fait presser la détente de son pistolet, tuant Ben et laissant Marko rongé par les remords. Peter pardonne à Marko, qui se désagrège et s’envole au loin. Peter et Harry se pardonnent mutuellement, avant qu’Harry ne meure, de la même manière que son père. Après l’enterrement de Harry, Peter et Mary Jane se retrouvent et commencent à réparer leur relation.

Source: Wikipédia